基于金纳米簇的肿瘤活体多模态分子影像研究

前 言

So 等人报道了基于 BRET 的自发荧光成像。在实验中他们成功将 Luciferase 催化的生物发光作为能量供体激发了CdSe/ZnS 量子点，在无激发光源的条件下使量子点实现在体成像 [2]。Zhang 等人则报道了利用 CLRET 实现深部组织探测的研究。在研究中，他们利用鲁米诺被氧化时所发出蓝光成功激发了 CdSe/ZnS 量子点，从而实现了深部组织过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）的探测 [4]。CRET 则由 RobinS.等人最先提出，并发现将放射性核素与量子点混合后，可以激发量子点产生荧光 [5]。我们实验室进一步的研究证实，CRET 的确可以用于激发长波长量子点，并可用于小动物在体成像 [6, 7]。然而，QDs 一般是由 Cd、Pb、As 等重金属材料组成，且其表面修饰也常需要有毒物质，如十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, CTAB）。研究发现 QDs 在生物体内使用时，内部的重金属粒子会不断自发释出，可对生物体造成直接毒性损害 [8, 9]。QDs 的生物安全性和潜在环境危害限制了 QDs 研究的进一步临床的转化。即便无毒 QDs 的研究取得了一些进展，QDs 目前还不具备在体临床使用的条件 [8,10,11]。因此研发全新安全性高，生物相容性好的能量受体是进一步推动自发荧光成像临床转化和应用的目标。近几年，贵金属纳米簇，特别金纳米簇（goldnanocluster,AuNCs），由于荧光稳定，安全性高，生物相容性好，水溶性佳等特点，日渐成为在体成像和探针研发中的新热点 [12-19]，需要特别指出的是，贵金属纳米簇合成常使用具有生物功能的大分子（如蛋白、短肽、酶等）作为模版，因而在生物体内可表现出优良的胶体稳定性、高溶解性、低非特异性摄取等特点 [15, 19, 20]。同时生物大分子众多的生物活性基团（-NH2、-COOH 等）为表面功能修饰提供了大量的位点 [21, 22]。以上优点使贵金属纳米簇有望成为新一代自发荧光成像的能量受体。

本课题中，我们系统设计和制备了具有自发荧光成像功能的双模态探针64Cu-doped AuNCs，该探针可进行正电子发射断层成像（positron emitting imaging, PET）和近红外（Near-infraredimaging,NIR.）自发荧光成像（如图 1）。放射性64Cu 一方面作为能量供体用以激发 AuNCs，另一方面作为 PET 成像的示踪剂。在此过程中，我们建立了无需金属螯合物的 AuNCs 快速放射性标记方法（标记约 1 小时）。所制备的64Cu-doped AuNCs 展现了优良的在体荧光稳定性、水溶性和分散性、低毒、高生物相容性等特点。在 U87MG 肿瘤移植瘤模型上，64Cu-doped AuNCs 成功实现了在体肿瘤双模态成像。高效清晰的 PET 和自发近红外荧光成像展现了64Cu-doped AuNCs作为新型肿瘤多模态成像探针的巨大潜力。......

文献回顾

1. 肿瘤的流行病学、诊断及治疗现状和所面临的挑战肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，其总体发病率在全球范围内居高不下。仅 2021全年，全球新发癌症病人就有一千四百万。据世界卫生组织估计，肿瘤发病率仍将保持上升态势，未来二十年将增长 70%[23]。我国是肿瘤疾病的高发国家，据中国肿瘤登记中心 2021 年年报显示，我国恶性肿瘤发病率为男性 274.69/10 万，女性 197.24/10万，因肿瘤导致死亡的人约为 210 万人/年。按照我国人口平均寿命 74 岁计算，一生中患恶性肿瘤的机率高达 22 %。因此，肿瘤已成为严重危害国人的健康，消耗大量医疗资源，增加社会和家庭经济负担的重大疾病。诊断要早、治疗要精、监测要准;是现代医学对肿瘤诊断和治疗提出的全新挑战。它不仅要求在诊断上能在肿瘤发展初期就发现其存在；在治疗上，更能根据不同肿瘤的特点选择、制定个体化;的治疗策略，并能对所选治疗手段的有效性进行快速甚至是预先判断，及时指导临床治疗方案。令人遗憾的是现行的肿瘤诊断及治疗监测手段主要依据肿瘤形态学的变化，难以早期判断肿瘤的发生和及时反映肿瘤治疗的疗效。这就需要我们必须创新诊断和治疗模式，探索和研发全新的肿瘤诊疗新策略。探索不同于以往肿瘤诊断诊断及监测新方法，揭示疾病发生、发展过程中的分子机制和功能变化，是当代医学诊断和治疗研究中极具挑战的前沿方向 [24]。研究表明，肿瘤细胞关键分子的改变早于形态学变化。抓住肿瘤发生发展及治疗过程中重要分子变化就有可能实现肿瘤的早期诊断和精确疗效预测。因此，研发可识别肿瘤关键分子变化的全新肿瘤诊疗手段，将大大提早肿瘤诊断与处置时间，增加疗效效果判定的准确性，提高肿瘤治疗的针对性和有效性。......

2. 分子影像学在肿瘤相关研究中的作用分子影像学（MolecularImaging）是本世纪初刚刚诞生的一门新学科。它的诞生得益于人们近几十年来在细胞生物学、疾病靶点筛选、新成像药物、小动物成像仪器方面所取得的巨大成功。分子影像学可在活体现实（人和动物）下通过非侵入的手段，在细胞及分子水平上观察、定量和表征生理或疾病发生发展的全过程，是一门包含化学、生物学、基础物理学、医学、制药学、生物医学工程等众多学科的交叉科学 [25]。正如 16 世纪末第一台显微镜催生了以形态学观察为主的早期生物学发展一样，分子影像学正催动着新一轮疾病诊断研究和药物研发领域的革命。现有影像学诊断技术主要是基于疾病形态学改变，通过对比病灶与正常组织间在解剖位置、结构、质地等属性的差异来诊断疾病的。目前形态学诊断方法，肿瘤大小需要至少在厘米级，甚至更大才可能被发现。而在此阶段，肿瘤团块已至少含有 1×109个细胞，因而大多数肿瘤在发现时都已进入晚期。我们知道，早期诊断对肿瘤病人的治疗和预后意义重大。通常 I 期的肿瘤五年生存率大于 90%，如果能在此阶段探测到肿瘤，甚至在更早的癌前病变阶段能够早期干预，肿瘤往往就可以治愈甚至预防 [26]。与前者不同的是，分子影像技术使用的是可与疾病特异性靶点相结合的分子探针作为成像的示踪剂。成像诊断策略上彻底的变革，使分子成像具备对疾病早期分子事件;探测的能力，从而使肿瘤的早期诊断成为可能 [24,27]。比如，在肺癌动物模型上，分子影像通过对癌基金 ras 现实的检测，成功实现对仅 1 mm 大小肿瘤的探测 [28]。在前列腺癌患者上，通过靶向淋巴结中巨噬细胞的磁性纳米材料，MRI 可定位以往很难发现的毫米级转移淋巴结 [29]。其次，分子成像借助于特殊靶向成像探针，可早期判定和实时监测肿瘤治疗的反应，并此基础上评价治疗策略的有效性，为制定和调整精准化治疗;方案提供依据。精准医学（Precisionmedicine,PM）是 2021 年刚刚提出的新概念，是指医疗的整个过程，即诊断、治疗决策均依据病人个体化的疾病的生物学、病理及基因特点 [30,31]。2021 年，美国总统奥巴马签署一项高达 2.15 亿美元的预算专门用于精准医学的研究，可以说，精准医学代表着未来医学的发展方向。分子影像通过特异性探针可精准观察肿瘤在治疗中的分子变化，协助医师对治疗效果进行早期判断及预测，及时调整和优化治疗策略和用药，最大限度上扩大治疗效果，从而达到精准治疗;的目的。比如，作为临床使用最广泛的分子影像探针氟-18 去氧葡萄糖（2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose,18F-FDG），可对肿瘤葡萄糖代谢水平进行分析，被广泛用于乳腺癌、结肠癌、食管癌、头颈部肿瘤、肺癌等多种肿瘤的分级分期及评价肿瘤治疗效果的手段。最近的研究和统计结果表明在进展期卵巢癌患者中，18F-FDG 在化疗药物疗效评价上甚至比血清学标志物 CA-125 还要准确 [32]。再次，分子成像技术可大幅简化和缩短抗肿瘤药物的研究时间，大幅减少经费投入。一个药物从研发到最终成功上市，其过程往往耗资超过百亿美元，长达10-20 年的研究周期。在此过程中，多数药物在研发过程中会被逐渐淘汰 [33]。分子影像通过对药物作用靶点或其下游分子的活体成像，可在活体水平直接证实药物的靶向性及作用机制，从而简化药物研发过程中大量的结构比对、生物信息学靶点分析，以及大量繁琐的动物学、药代动力学、药效学实验，明显加快药物研发的进程。

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第三部分64CU-DOPED AUNCS 的体内多模态成像研究与评价·······661. 材料 ·····························671.1 试剂与耗材 ························671.2 实验仪器 ······················671.3 细胞系及实验动物 ·················682. 方法 ···························682.1 荷瘤动物模型建立 ·····················682.264Cu-doped AuNCs 荷瘤动物的 PET 成像··········692.364Cu-doped AuNCs 荷瘤动物的自发荧光及契伦科夫成像 ·····69

第三部分64Cu-doped AuNCs 的体内多模态成像研究与评价

多模态成像通过整合多个模态的成像方法，在克服各成像模态间的不足的同时，整合了各个成像模态间的成像优势。较传统单模态成像的方式，多模态成像实现了提供更为全面，互补的疾病信息。然而，多模态成像有赖于性能优良的多模态成像探针。理想现实下，多模态分子探针的设计应该满足在同一探针上实现在多个模态的成像探测，而非多次使用不同探针将多个成像模态扫描结果进行简易拼合;。纳米材料拥有相对大的表面积，可进行多种的功能修饰且较生物分子物理性质和结构不易受到破坏。经过改造纳米材料表面可承载用于多成像模态的成像模块，因而是多模态分子成像的理想载体。金纳米材料以其优良的荧光性能使其成为荧光成像理想的荧光材料，常作为生物传感器用于体外重金属粒子的检测。然而在现有发表的研究中，尚无关于金纳米簇多模态成像的研究报道。本研究所制备的64Cu-doped AuNCs 使金纳米簇同时具有了PET 成像和基于 CRET 原理的自发近红外成像（Self-illuminating NIR imaging）功能。特别是自发近红外荧光成像，与传统荧光成像相比，避免了自体荧光干扰，以及组织吸收、散射所造成的激发光减弱。同时也进一步拓展了契伦科夫成像的应用。上一部分实验，我们证明了64Cu-doped AuNCs 在体外条件下的 PET 成像及自发近红外成像。那么在体内，特别是在肿瘤模型上64Cu-doped AuNCs 可否实现 PET 成像及自发近红外成像是本节需要着重解决和回答的问题。本部分，我们将在荷瘤小鼠模型上，通过一系列动物实验对64Cu-doped AuNCs 在体 PET 及自发近红外成像效果、探针生物学分布、器官安全性进行综合性评价，系统评价和建立64Cu-dopedAuNCs 体内多模态成像的方法。

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小 结

1. 本论文首次使用 HSA 作为模板，成功合成具备 NIR 成像功能的 AuNCs。该 AuNCs粒径小，荧光稳定。CD 谱研究表明，作为 AuNCs 保护基团的 HSA 与天然 HSA相比构象未发生明显变化，仍最大程度上保持其原有形态，使探针模拟了 HSA优良的在体生物动力学特征；2. 本论文首次报道了 AuNCs 的快速放射性标记方法。在无螯合剂的条件下，64Cu作为探针的直接构成元件，通过水合肼直接还原于 AuNCs 表面。该方法标记率高，稳定性好，ITLC 显示64Cu 几乎全部被标记；3. 本论文首次报道了放射性核素和 AuNCs 间可发生 CRET，并可实现自发荧光成像。所制备的多模态探针64Cu-doped AuNCs 较64Cu 契伦科夫辐射在近红外区信号有较大提高，同时还兼具 PET 成像的功能；4. 在体成像结果表明，64Cu-doped AuNCs 生物安全性好，可被肿瘤组织高摄取，具有较好的在体 PET 成像及自发 NIR 荧光成像效果。64Cu-doped AuNCs 是一款新型肿瘤多模态成像探针，具有广阔的应用前景。

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参考文献（略）