狂犬病的探索治疗以及相关病毒在神经科医学中的应用

第一章 文献综述1.1 狂犬病的危害在狂犬病病毒（RABV）感染哺乳动物后，会侵染神经元，在神经元内完成病毒的复制周期并在神经元间进行传播和转移，导致中枢系统中神经元活动失调，使得宿主在自身免疫系统针对病毒产生抗体来保护机体之前就彻底发病，最后导致宿主死亡。目前，就 RABV 而言，已经在全世界范围内导致了大量的人畜死亡，死亡率几乎 100%，而当前的防控手段只有使用疫苗来进行预防[1-3]。在狂犬病的治疗史，只有美国在 2004 年存在一例患者由蝙蝠传播的 RABV 感染发病后，经过密尔沃基疗法，即使用麻醉术来降低病人的神经活动失调的救治方式得以治愈，而同样的方法在犬源 RABV 感染发病的患者中至今未有成功实例，主要原因可能是该患者所感染的蝙蝠源性的 RABV 属于弱毒株，发病慢。事实上，很多例狂犬病患者存在神经损伤，以及因神经活动损伤和高烧等诱发的呼吸衰竭，心脏衰竭和脏器损伤等症状。而在狂犬病患者发病之初，通过降低持续的中枢神经活动失调，或许可以延长患者的寿命，降低神经损伤及其并发症，为机体免疫系统产生抗体并清除病毒赢得宝贵时间[4]。..........1.2 Memantine 在神经失调中的应用美金胺（Memantine）是一种中等亲和力的非竞争性 N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA 受体）拮抗剂，容易穿过血脑屏障，使得其在脑脊液中的分布于血液中浓度相似[5-8]。Memantine 能够明显缓解 NMDA 受体失调所引起的相关症状，并随着用药时间增加有效降低神经活动失调这一状况及其诱发的相关病症。这些神经性疾病包括：阿尔兹海默症、青光眼、癫痫、神经退行性疾病、脑神经损伤、脑内神经紊乱、药物成瘾、脑缺血等，精神性疾病包括抑郁、忧虑、躁动和药物依赖等，并在美国作为针对阿尔兹海默症的药物批准上市的[9-11]。本研究中根据Memantine的作用机理尝试对 RABV等嗜神经病毒引起的神经活动失调的症状进行针对性探索治疗，希望对狂犬病的症状有所缓解，在减轻患者痛苦延长生命时间为免疫系统争得更多时间的同时，也为治疗以狂犬病为例的嗜神经病毒引发的症状提供治疗的经验和思路。............1.3 狂犬病病毒在神经科学中的应用病毒类生命体是生命进化过程中一种古老的生命形式，随着自身与宿主的相互依存的现实，二者共同进化，相互依赖，很多病毒在能够导致宿主患病甚至死亡的同时，也有对机体有利之处，所以在生命科学高度发展的今天，病毒既是人类需要防治及治疗的工具，也是人类可以用来改造和利用的对象。在本研究中较典型地展示了狂犬病病毒（RABV）经过改造后在神经科学中的广泛应用。目前在神经科学领域，需要有效的工具从结构和功能上解析大脑。而在以上列出的诸多神经标记技术中，通过嗜神经病毒的感染性来对神经网络进行示踪，是目前较为有效而准确的手段之一。同时随着现代分子生物学和病毒学的发展，是对这些嗜神经病毒的改造和制备更为容易而且多样化。科研人员通过对病毒的改造来完成对特定神经环路在全脑水平的形态，结构，功能以及行为学上的探索和操控，以此来揭示脑神经科学领域的奥秘。狂犬病病毒（RABV）是弹状病毒科狂犬病毒属，其基因组是单股负链 RNA，结构较简易，只编码 5 个蛋白，即核蛋白（Nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrix protein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）和聚合酶（Polymerase，L）[12]。RABV 的神经嗜性很高，野生型的 RABV 只在哺乳动物的神经内传播并在神经中枢复制，再经由唾液腺分泌到唾液中，通过被感染动物的撕咬进入到其他动物体内，从神经与肌肉的轴突末端进入到另外动物的中枢[13]。所以，在神经元的突触之间 RABV 是严格的逆突触传递，从一个神经元的突触后膜传播到上一级神经元的突触前膜[14]，然后在单个神经元的内部，从轴突向胞体逆向运输，最后在胞体完成自身的复制过程[15] [16]。在针对狂犬病的长期研究中，人们获得了 RABV 的疫苗株（人用的 Hep-flurry 株和兽用的 SAD 株等），并通过反向遗传学的手段将其基因组插入到质粒中，连同启动病毒复制的四个必须的蛋白（N，P，G 和 L）分别克隆到载体中，将这 5 个质粒共同染到 BSR 细胞中，经过较长时间的培养，即可得到重组的狂犬病病毒的颗粒[17-22]。...........第二章 本研究的目的与意义本研究中通过使用神经元的 NMDA 受体拮抗剂美金胺，来尝试缓解 RABV等嗜神经病毒引起的神经活动失调；对病毒的神经元损伤起到一定程度的保护作用，延长受感染宿主的生存时间，为其体内的免疫系统发挥作用争取时间，为狂犬病治疗提供思路。同时本研究也着眼于 RABV 在神经科学中的应用，尝试通过解析具体的视觉神经系统的部分环路来作为示范，将初级视觉皮层的部分神经元根据其不同的靶标核团进行区分标记，从而得到基于初级视觉皮层到丘脑的微环路，以此为基础进一步在结构和功能上，在形态学和行为学上等多角度对解析得到的初级视觉皮层的神经微环路进行评价和研究，最终在单眼剥夺的病理模型水平对其进行验证，也进一步结合了光遗传学和光纤检测钙信号系统在自由移动的清醒动物中验证了 V1-丘脑核团微环路的可塑性。..........第三章 材料和方法.............233.1 试验材料和设备........... 233.2 实验方法 .............28第四章 Memantine 对狂犬病的探索治疗...........474.1 结果与分析 .........474.1.1 Memantine 细胞水平的保护作用.........474.1.2 Memantine 对 RABV 感染小鼠保护实验......484.1.3 Memantine 对 EV 感染小鼠保护实验..........484.2 讨论 ...........504.3 小结 ............51第五章 RABV 在视觉神经环路示踪的应用....525.1 前言 ...........525.2 实验病毒准备..... 525.3 讨论........... 685.4 小结........... 73第六章 V1 到丘脑核团微环路功能的探索本室通过运用 rRABVΔG 病毒携带荧光蛋白基因的方式对 V1-丘脑核团的微环路投射关系进行了分布和形态上的解析，也进一步使用 rRABVΔG 病毒携带钙离子指示蛋白 GCaMP6s 的基因对这些已经分群的微环路在功能上进行探索，又结合病理水平的单眼剥夺（Monocular Deprivation，MD）实验研究 V1-丘脑三核团环路的突触可塑性变化。6.1 V1-丘脑核团的微环路的神经活动差异性通过向小鼠脑内 LD、LP 和 dLGN 核团定位注射 rRABVΔG-GCaMP6s-Dsred2病毒，将小鼠头皮缝合后，在病毒注射后第 7 天（T=7 dpi.），去掉头皮后在需要观察的 V1 区域实施颅骨磨薄手术，并覆盖小玻片和牙科水泥加以保护，来完成对双光子对V1深层神经元在体成像和神经活动检测前的动物准备（如图6-1A。B所示）。在完成小鼠注射和手术后 10 d，相关蛋白 GCaMP6s 和 Dsred2 的表述水平足够高且病毒并未产生明显神经毒性。通过双光子显微成像技术对小鼠活体进行脑部 V1 区域神经元成像，成像过程中小鼠需处于麻醉现实，使用低混合比的异氟烷作为麻醉剂，同时为了屏蔽小鼠呼吸产生的震动导致聚焦平面失焦的现象，将小鼠头部固定塑料片和特制的成像支架上，同时用加热装置为小鼠保持体温。双光子显微成像技术在小鼠脑内的成像深度依赖于双光子光源的激发光波长，激发光的波长越长，成像深度越深，同时长波段的激发光能量较弱，需要增强光源的输出功率，则会导致激光器在长波段输出时激光器锁模效率下降，需额外增强磷砷化镓（GaAsP）PMT 光谱检测器的灵敏度，在灵敏度增加的同时，检测到的荧光噪音也会随之增加。所以需要将检测器灵敏度调整到噪音可以接受的范围来解决上述连锁问题。同时照顾到 GCaMP6s 和 Dsred2 两种荧光蛋白的激发波长，将激发光波长调整到 920 nm，形成一激二;的应用模式，通过 GFP/RFP 双色滤光模块将两种发射光分开。因为 GCaMP6s 的荧光会随钙离子的浓度升高而变亮，而 Dsred2的荧光不会受到神经活动的影响，所以 Dsred2 的红色荧光可以作为 GCaMP6s 检测神经活动的绿色荧光的参考基线，保证检测到的绿色荧光变化不是因为小鼠呼吸抖动或热漂移等失焦因素造成，同时红色荧光也有利于示踪整个神经元。

...........小结1) 在麻醉现实下小鼠自发现实的 V1-LD、V1-LP 和 V1-dLGN 核团微环路神经元接受到上游神经元的动作电位水平有差异，且对接受到的动作电位的反应也各不相同，总体上 V1-LP 环路接受到的动作电位水平较高，且产生的树突神经活动也更为频繁；2) 在单眼视觉剥夺小鼠中，从形态学和在体功能水平上，V1 到丘脑核团的环路的可塑性相比野生型都有明显的降低，这种环路水平的可塑性降低导致rRABVΔG病毒逆行标记 V1 神经元的减少，也导致了激活 V1 神经元后向下传递到丘脑核团的动作电位的减弱。..........参考文献（略）