Bub1蛋白在前列腺癌中的表述及临床意义
前 言
我国前列腺癌的发病率与欧美国家相比较低，但近年来随着我国人口老龄化的日趋严重以及医疗水平的快速发展，前列腺癌发病率在我国呈现明显上升趋势，而且增长速度已经超过欧美国家，全国肿瘤防治研究办公室/全国肿瘤登记中心收集国内30个登记处统计的数据显示，1988～1992 年的前列腺癌发生率为 1.96/10 万人口，1993～1997 年为 3.09/10万人口，1998～2002 年为 4.36/10 万人口[3]。国家癌症中心近几年统计数据显示：自 2008 年以来，泌尿系统中前列腺癌的发病率已经超过膀胱癌成为该系统发病率最高的肿瘤，2009 年前列腺癌的发病率达 9.92/10 万人口，在男性所有恶性肿瘤中发病率排名第 6，死亡率达到 4.19/10 万人口，在男性所有恶性肿瘤中位列第 9[4-5]。目前，前列腺癌已经成为影响我国老年男性健康的重要因素之一[6]。前列腺癌早期，大多数患者通常没有明显症状，而且我国城乡居民体检意识相对较差，有相当比例的患者来我院就诊时临床分期较晚甚至已经发生远处转移，前列腺癌最常发生的转移部位是骨骼，骨转移严重者会引起疼痛、病理性骨折、脊柱部位的转移还会压迫脊髓、神经根或马尾，引起相应的神经系统症状，这将使患者生活质量受到严重影响[7]，当前列腺癌患者出现远处转移则失去了根治性治疗的机会。对于不能采取根治性手术或者根治性放疗的晚期前列腺癌患者，内分泌治疗是目前国际一致强烈推荐的一线治疗方案[8]，包括单纯去势治疗（手术或药物）、单一抗雄激素治疗、间歇内分泌治疗、最大限度雄激素阻断（maximal androgen blocade ,MAB）等，我们所采用的是最大限度雄激素阻断治疗，伴有骨转移的患者加用双膦酸盐治疗。采用内分泌治疗的前列腺癌患者往往经过一段时间的治疗后（18～24 个月），会逐渐对雄激素剥夺治疗变得不敏感，进而出现疾病进展，即进展为去势抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer ,CRPC），前列腺癌患者主要的死亡原因是疾病进展为CRPC 后缺乏有效的治疗方案，预后很差，这类患者的中位生存时间仅为 10～12 个月[9]。目前，前列腺癌的发生、发展及转移机制尚不明确；因此，对前列腺癌进行进一步的研究尤为重要。细胞是机体的基本组成单位，而机体的生长、发育及各项生命活动有赖于细胞不断进行的有丝分裂。细胞的有丝分裂是一个高度有序的过程，按顺序依次为：G1期(DNA合成准备期)、S期(DNA合成期)、G2期(有丝分裂准备期)和M期(有丝分裂期)，其中M期(有丝分裂期)又可以分为：分裂前期、分裂中期、分裂后期和分裂末期，该过程受到精密而严格的调控，从而保证了有丝分裂正确进行，进而保证机体生长、发育以及生命活动正常进行。细胞在进行有丝分裂时，母细胞发生染色体复制，并于分裂结束后将染色体平均分配到两个子细胞中，从而保持了遗传物质的稳定性，在染色体分配过程中纺锤体检查点（spindleassembly checpoint, SAC）又称有丝分裂检查点，发挥着重要作用，其功能缺陷可导致有丝分裂过程中染色体分配出现错误，形成非整倍体，即引起细胞染色体不稳定性；与正常二倍体细胞相比，非整倍体细胞容易发生恶变[10-11]。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白-1（budding uninhibited by benzimidazoles-1 , Bub1）是一种由Bub1基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是纺锤体检查点的重要组成部分[12]，参与有功能的着丝粒形成，Bub1蛋白处在G1期或G2期细胞的着丝粒上，在着丝粒组装过程中起到重要的作用[13]。Bub1蛋白表述异常会使纺锤体检查点功能受损，当细胞进行有丝分裂时会导致染色体不稳定性的产生[14-15]。研究发现，Bub1蛋白表述异常与人类多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[16-17]。
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材料与方法1 实验材料1.1 标本收集选自 2021 年 5 月～2021 年 5 月郑州大学附属肿瘤医院病理科已确诊为前列腺癌穿刺存档蜡块标本 118 例，并取同期因前列腺增生于我院行手术治疗的前列腺增生石蜡包埋组织标本 40 例。所选前列腺癌患者穿刺前均未接受内分泌治疗、放疗或化疗，前列腺癌患者确诊后有 28 例行前列腺癌根治术，余 90 例均采用最大限度雄激素阻断治疗，有骨转移者加用双膦酸盐治疗。行前列腺癌根治术的患者，术后严密随访，直至出现生化复发、局部复发或者远处转移后随访终止，采用最大限度雄激素阻断治疗的前列腺癌患者，当疾病进展为去势抵抗性前列腺癌后随访终止。前列腺癌的病理分级采用Gleason评分系统，该评分系统把前列腺癌组织分为主要分级区和次要分级区，每区的Gleason分值为1～5分，把主要分级区和次要分级区的Gleason分值相加，形成癌组织分级常数，即为前列腺癌Gleason评分。Gleason评分系统在临床上应用相当广泛，是前列腺癌诊断、制定治疗方案和预后判断的重要参考指标之一[32]，在前列腺癌危险因素分级中Gleason评分是重要组成部分，其中Gleason评分≤6分属于低危，7分属于中危，≥8分属于高危。本研究中前列腺癌患者临床分期Ⅰ期0例、Ⅱ期11例、Ⅲ期26例、Ⅳ期81例（2002年ACC前列腺癌TNM分期及分期编组）；Gleason评分≤6分35例、7分42例、≥8分41例（当同一患者各穿刺点Gleason评分存在不同时，选取最高分）；90例采用最大限度雄激素阻断治疗患者中，进展为去势抵抗性前列腺癌时间≥18个月27例，＜18个月63例。1.2 主要实验试剂及来源（1）兔抗人Bub1多克隆抗体（一抗）：购自艾博抗（上海）贸易有限公司，试剂编号Anti-Bub1 antibody ab70372，工作浓度1∶100。（2）过氧化物酶标记的链霉卵蛋白素(Streptavidin/Peroxidase ,SP)检测试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（3）浓缩型二氨基联苯胺(Diaminobenzidine ,DAB)试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（4）PBS磷酸盐缓冲液：购自郑州莱宝实验器材有限公司。（5）二甲苯及酒精：购自上海化学试剂有限公司。（6）苏木素：购自上海化学试剂有限公司。
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2 实验方法：免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(S-P)方法2.1 实验原理（1）冲洗液（0.01M PBS PH7.2～7.4）：用购于郑州莱宝实验器材有限公司PBS磷酸盐缓冲液粉末1包溶于2000ml蒸馏水中，混匀后备用。（2）DAB显色液：将一滴试剂A(浓缩缓冲液) 加入1ml蒸馏水中，混匀，再依次将试剂B(浓缩DAB溶液)和试剂C(浓缩过氧化氢溶液)各一滴加入其中，再次混匀。此溶液现配现用，配制完成后避光保存，30分钟之内使用，剩余溶液弃去不用。石蜡切片，脱蜡至水：将组织标本蜡块用切片机4μm连续切片，然后放入60℃电热恒温烤箱中烤片2小时，取出玻片后放入二甲苯溶液（15分钟×2次），进行脱蜡；随后取出依次放入无水乙醇（5分钟×2次）、95%乙醇（5分钟×1次）、90%乙醇（5分钟×1次）、85%乙醇（5分钟×1次）、80%乙醇（5分钟×1次）；脱水后用PBS缓冲液进行冲洗（5分钟×3次）。高压抗原热修复，需要进行抗原修复的原因是组织蜡块标本在制作过程中需要用甲醛固定，在保存过程中甲醛本身会形成羟甲基，其渗入组织细胞后与细胞内抗原发生反应会形成醛键，这两种化学基团可封闭部分抗原决定簇，此外，蛋白与蛋白之间以及甲醛与蛋白之间发生交联，形成交联蛋白，也会隐蔽部分抗原，因此为了更好地使抗原暴露出来，以便在进行免疫组化染色后获得较好的染色效果，需要进行抗原修复，进行抗原修复的方法有很多种，本实验采用高压抗原热修复法。将组织玻片依次放在玻片架上，高压锅内加入适量PH6的柠檬酸盐缓冲液，然后将玻片架完全浸入其中，盖上锅盖，打开排气阀，看到蒸汽时后开始计时，4分钟后断开电源，然后用流动的自来水冲洗高压锅至室温，取出玻片架，PBS冲洗液进行冲洗（5分钟×3次）。
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前 言..............................................1材料与方法...........................................4结 果................................................8讨 论.............................................10结 论...............................................15参考文献...........................................16附 图...............................................19
讨 论
早期前列腺癌可以通过手术或放射治疗获得根治，这类病人预后较好，但大多数前列腺癌患者早期没有明显症状，外加我国城乡居民体检意识相对较差，很大比例的患者已经出现严重的下尿路梗阻症状，甚至出现骨痛，严重影响生活时才来院就诊，这类患者经过检查后大部分临床分期较晚甚至已经发生骨转移，失去根治的机会。对于这部分患者一线的治疗方案是内分泌治疗，往往能取得较好的疾病控制效果，但目前晚期前列腺癌所面临的困境是患者经过一段时间的内分泌治疗后（18～24个月），会逐渐对雄激素产生非依赖而进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer ,CRPC）[9]，2021版中国泌尿外科疾病诊断治疗指南对CRPC的定义是经过初次持续雄激素剥夺治疗后疾病依然进展的前列腺癌，应同时具备以下条件：（1）血清睾酮达去势水平（＜50ng/dl 或者＜1.7nmol/L），（2）间隔1周，连续3次PSA上升，较最低值升高50%以上。化疗是CRPC的重要治疗方法，其中以多烯紫杉醇加泼尼松方案最为常用，但这类患者化疗效果有限，病人预后较差，CRPC的治疗仍然面临很多困境，是世界性难题[33-34]。目前，前列腺癌的发生、发展及转移机制尚不明确。
近年来研究发现，细胞有丝分裂过程中纺锤体检查点（又称有丝分裂检查点）的功能缺陷可导致子细胞染色体不稳定性产生，而这类细胞容易恶变，这与肿瘤发生、发展密切相关[10]。细胞是构成机体及维持机体生命活动的基本单位，机体的生长发育及各项生命活动与细胞的有丝分裂密切相关。细胞在进行有丝分裂时，母细胞的染色体经过复制后平均分配到两个子细胞中，从而保证了遗传物质的稳定性；有丝分裂过程必须在严格监控下精确进行，以保证有丝分裂过程中染色体复制和分离等过程的忠实性。有丝分裂的检查机制主要包括：G1/S检查点、S期检查点、G2/M检查点、纺锤体检查点，这些机制保证了细胞在有丝分裂过程中时间与空间的有序性，其中纺锤体检查点是有丝分裂过程最后的监控机制[35]。纺锤体检验点包括Mad1-3（mitotic arrest deficient 1-3）、Bub1-3（budding uninhibited by benzimidazoles 1-3）、Msp1（monopolar spindle 1）等蛋白[36]，其在有丝分裂中对纺锤体与染色体的组装过程进行反馈式监控，主要作用是监控细胞有丝分裂中期所有的染色体与纺锤体微管正确连接并排列在细胞赤道面上，细胞方能进入有丝分裂后期，从而保证染色体精确分配到子细胞中，当这一过程出现错误时，纺锤体检查点将使细胞周期停滞于分裂中期，而不进入分裂后期，并启动补救措施，直至错误被纠正后细胞周期才得以继续进行，这种检查机制防止子细胞染色体出现数目异常，保证了染色体的稳定性。如果纺锤体检查点存在功能缺陷，即使在有丝分裂中期出现差错，补救措施无法正常启动，细胞周期仍会继续进行，导致染色体分离过程出现差错，形成非整倍体，而非整倍体细胞的染色体稳定性较差，易发生恶变，研究已经证实染色体不稳定性与多种肿瘤的发生、发展密切相关[37]。
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结 论
Bub1基因发生突变的机率极低，Bub1蛋白在前列腺癌组织中表述降低，可能由于癌组织中Bub1的上游基因发生突变而导致，也可能是由于染色体检查点被激活，消耗Bub1蛋白所致[42]。有研究发现[43]Bub1蛋白表述降低会导致抑癌基因P53介导的非整倍体细胞凋亡通路功能受损，这将导致机体非整倍体细胞的累积，进而会引起细胞恶变，导致肿瘤的发生。最新研究证实Bub1在TGFβ信号通路发挥重要作用，是重要的调控因子，Bub1可以促进TGFβRI/II受体复合物的形成，并与TGFβRI/II受体复合物一起形成三聚，调控TGFβ信号通路的下游信号级联，Bub1表述下调可影响TGFβ依赖的EMT，而EMT被证实与包括前列腺癌在内的多种肿瘤的侵袭、转移过程密切相关[18]，这些机制进一步说明Bub1蛋白表述降低与前列腺癌发生、发展、转移及预后密切相关；对Bub1蛋白的结构、功能、表述调控机制等，进行深入的研究，将有益于从分子水平进一步阐明Bub1在前列腺癌发生、发展及转移中发挥的作用，最终或许可以为前列腺癌的诊治提供一种新的临床思路。
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参考文献（略）