Tiam1在内膜增生中的作用及机制
第一章引言
随之发展，冠脉搭桥术后的搭桥血管狭窄和 PCI 术后支架内再狭窄或者血栓成为限制两者发展的最大障碍。虽然药物洗脱支架的出现使得术后支架内再狭窄可能性大大下降【1】，但是有些严重患者仍旧需要行冠脉搭桥手术治疗。同时，有研究显示支架内再狭窄患者急性心肌梗死发生率更高【2】。故而可见，血管内再狭窄会产生严重后果，给社会和个人带来巨大负担。血管内膜增生和血管重塑被认为是血管再狭窄的根本原因【3】。所以，深入探索内膜增生的机制是十分重要的。内膜增生过程中，平滑肌细胞的表型改变、增殖与迁移是其发展过程中十分重要的环节【4-6】。
小 G 蛋白家族之一 Rho 家族是许多细胞功能的调节蛋白，比如：细胞骨架重排、细胞迁移与极性的变化等【7】。而小 G 蛋白的活性受到 GEF 的调节，GEF 促进小 G 蛋白从 GDP 结合形式转变为 GTP 形式，从而获得活性。【8-11】Tiam1 作为一种 GEF，Tiam1在人体组织中广泛表述，尤其是在脑细胞、睾丸、上皮组织。【12】其主要激活小 G 蛋白 Rac1【13】，但是 Tiam1 也能够以直接的方式参与到对细胞迁移、细胞增殖、细胞应激等过程当中。【14-18】已有研究发现 Rho 家族参与平滑肌细胞的钙通道调节。【19】也有研究发现不表述 ephrin-B2 的小鼠其 Tiam1-Rac1 信号通路活性下降，伴有血管壁缺损和动脉瘤的形成。【20】然而，纵观目前研究中尚未发现其直接对于平滑肌细胞的作用。故而推测，Tiam1 也能参与到内膜增生过程中，并且对平滑肌细胞产生影响。
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第二章 Tiam1 在平滑肌细胞中的表述
2.1 实验动物及实验材料2.1.1 实验动物2.1.1 实验动物雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠（SPF 级）购买于上海斯莱克实验动物有限公司。饲养于上海市第十人民医院中心实验室动物实验中心，恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，人工光照明暗各 12h。2.1.2 实验药品及实验仪器实验药品（1）水合氯醛：上海天奇生物有限公司（2）Tiam1 抗体：Abcam Biochemicals 公司（3）荧光二抗-抗兔:Amersham 公司（4）HiPerFect Transfection Reagent:Qiagen 生物科技有限公司（5）DMEM(低糖): Hyclone 公司（6）胎牛血清：Hyclone 公司（7）Tiam1 siRNA: sigma 公司（8）胶原酶Ⅱ：上海威奥生物科技有限公司（9）弹性蛋白酶：上海威奥生物科技有限公司（10）β-actin：Cell Signaling Technology 公司实验仪器（1）低温高速离心机 5415R：Eppendorf 公司（2）高速离心机 5840R：Eppendorf 公司（3）纯水系统 Milli-Q：Millipore 公司（4）高精度电子分析天平 BSA224S：Sartorius 公司（5）微量加样器：Eppendorf 公司
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2.2 实验方法2.2.1 大鼠胸主动脉平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）原代培养及转染（1）原代培养1）3%的戊巴比妥钠（1ml～1.5ml/g）麻醉 SD 大鼠（250-300g）。2）开胸后沿脊椎剥离胸主动脉。3）将剥离好的胸主动脉放到盛有 HBSS 的培养皿中洗涤整洁。4）将洗整洁的血管放进胶原蛋白酶Ⅱ中 37 度孵育 20-30 分钟。5）剥离血管外膜后放在 20%低糖培养基中 37 度过夜。6）将过夜后的血管减成小块放到弹性蛋白酶+胶原蛋白酶 II 中消化。7）消化约 2 小时后用培养基终止消化并用移液器吹打均匀。8）将混悬液离心 900xg 离心 4 分钟，弃上清9）培养基吹打混匀后加到培养皿中均匀铺板。（2）转染1）按实验需要铺板,共分六组：siCtr+PDGF（0min）组、siCtr+PDGF（5min）组、siCtr+PDGF（15min）组、siCtr+PDGF（30min）组、siCtr+PDGF（60min）组、siCtr+PDGF（90min）组、siTiam1+PDGF（0min）组、siTiam1+PDGF（5min）组、siTiam1+PDGF（15min）组、siTiam1+PDGF（30min）组、siTiam1+PDGF（60min）组、siTiam1+PDGF（90min）组、PDGF 为 20ng/ml
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第三章 TIAM1 对血管平滑肌细胞迁移功能的影响...............83.1 实验对象及实验材料 ...............................83.2 实验方法 ............................................9第四章 TIAM1 对血管平滑肌细胞增值和凋亡的影响...........134.1 实验对象及实验材料 ..................................134.2 实验方法 .............................................14第六章 TIAM1 敲除对血管损伤后内膜增生的影响.............266.1 对象及实验材料 .....................................266.2 实验方法 .............................................27
第六章 Tiam1 敲除对血管损伤后内膜增生的影响
6.1 对象及实验材料6.1.1 实验动物3 只雄性 Tiam1+/-小鼠（SPF 级）和 3 只雌性小鼠 Tiam1+/-（SPF 级）有上海市瑞金医院提供。繁殖后获得 5 只雄性 Tiam1+/+小鼠（SPF 级）和 5 只雄性 Tiam1-/-小鼠，均饲养在上海市第十人民医院中心实验室实验动物中心，恒温（22±2）℃、恒湿（55±5）%，人工光照明暗各 12h。6.1.2 实验药品和仪器实验药品（1）Promega Wizard Genomic DNA Purification it A1120 上海盛兆生物科技有限公司（2）水合氯醛：上海天奇生物有限公司（3）琼脂糖：sigma 公司（4）SYBGreen：Amersham 公司（5）甲醛：sigma 公司（6）DAB 显色试剂盒：上海基因科技有限公司（7）苏木精：sigma 公司（8）NLRC5：Abcam Biochemicals 公司（9）TaaRa Ex Taq (DRR001A):上海皓嘉科技发展有限公司
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第七章结论与展望
7.1 结论（1）Tiam1 在血管平滑肌细胞中表述（2）PDGF 刺激下 Tiam1 在平滑肌细胞中表述量增加（3）Tiam1 敲除后减少血管内膜增生。（4）Tiam1 缺乏可以抑制平滑肌细胞的迁移。（5）Tiam1 缺乏抑制平滑肌细胞的增值，对于平滑肌细胞的凋亡作用并不明显。（6）Tiam1 能参与血管平滑肌细胞内 PI3-/At、P38MAP信号通路的激活。
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7.2 展望尽管人们研究血管内膜增生已经有很长的历史，目前了解了内膜增生的发生原因，过程中主要相关的病理机制和参与的细胞及分子机制。但是对于完全了解内膜增生仍旧有很大的差距。有效的抑制血管损伤后的内膜增生是人们开展研究的最终目标。深入研究内膜增生的病理机制可以帮助我们找到正确的靶向位点，研发出有效的治疗药物或治疗手段。Tiam1 作为一个在细胞内作用复杂的重要蛋白或许与内膜增生之间的存在密切的联系。因此，研究 Tiam1 与内膜增生之间的关系或许可以为研究道路上添砖加瓦，早日找到有效的治疗方法。
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参考文献（略）